Rantai polimerase reaksi (PCR) adalah teknik ilmiah dalam biologi molekular untuk memperkuat tunggal atau beberapa salinan sepotong DNA di beberapa kali lipat, menghasilkan ribuan sampai jutaan salinan dari urutan DNA tertentu.
Dikembangkan pada 1983 oleh Kary Mullis, PCR sekarang teknik umum dan sering digunakan di laboratorium sangat diperlukan penelitian medis dan biologi untuk berbagai aplikasi . DNA ini termasuk kloning untuk sekuensing, berbasis DNA filogeni, atau fungsional analisis gen, diagnosis penyakit keturunan, identifikasi sidik jari genetik (digunakan dalam ilmu forensik dan pengujian paternitas), dan deteksi dan diagnosis penyakit menular. Pada tahun 1993, Mullis dianugerahi Penghargaan Nobel dalam Kimia bersama dengan Michael Smith untuk karyanya pada PCR.
Metode ini bergantung pada siklus termal, yang terdiri dari siklus pemanasan dan pendinginan berulang reaksi untuk melelehkan DNA dan replikasi DNA enzimatik.Primer (fragmen DNA pendek) yang mengandung urutan komplementer ke wilayah target bersama dengan DNA polimerase (setelah mana metode bernama) merupakan komponen kunci untuk mengaktifkan amplifikasi selektif dan diulang.Sebagai PCR berlangsung, DNA yang dihasilkan itu sendiri digunakan sebagai template untuk replikasi, pengaturan dalam gerak reaksi berantai di mana template DNA secara eksponensial diperkuat. PCR dapat ekstensif dimodifikasi untuk melakukan berbagai macam manipulasi genetik.
Dikembangkan pada 1983 oleh Kary Mullis, PCR sekarang teknik umum dan sering digunakan di laboratorium sangat diperlukan penelitian medis dan biologi untuk berbagai aplikasi . DNA ini termasuk kloning untuk sekuensing, berbasis DNA filogeni, atau fungsional analisis gen, diagnosis penyakit keturunan, identifikasi sidik jari genetik (digunakan dalam ilmu forensik dan pengujian paternitas), dan deteksi dan diagnosis penyakit menular. Pada tahun 1993, Mullis dianugerahi Penghargaan Nobel dalam Kimia bersama dengan Michael Smith untuk karyanya pada PCR.
Metode ini bergantung pada siklus termal, yang terdiri dari siklus pemanasan dan pendinginan berulang reaksi untuk melelehkan DNA dan replikasi DNA enzimatik.Primer (fragmen DNA pendek) yang mengandung urutan komplementer ke wilayah target bersama dengan DNA polimerase (setelah mana metode bernama) merupakan komponen kunci untuk mengaktifkan amplifikasi selektif dan diulang.Sebagai PCR berlangsung, DNA yang dihasilkan itu sendiri digunakan sebagai template untuk replikasi, pengaturan dalam gerak reaksi berantai di mana template DNA secara eksponensial diperkuat. PCR dapat ekstensif dimodifikasi untuk melakukan berbagai macam manipulasi genetik.
Hampir semua aplikasi PCR mempekerjakan polimerase DNA yang stabil panas, seperti polimerase Taq, suatu enzim yang awalnya diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus. Ini enzimatis DNA polimerase merakit untai DNA baru dari DNA bangunan-blok, nukleotida, dengan menggunakan DNA beruntai tunggal oligonukleotida sebagai template dan DNA (juga disebut DNA primer), yang dibutuhkan untuk inisiasi sintesis DNA. Sebagian besar metode PCR menggunakan siklus termal, yaitu, bergantian pemanasan dan pendinginan sampel PCR untuk serangkaian langkah didefinisikan suhu. Langkah-langkah siklus termal yang diperlukan pertama yang secara fisik memisahkan dua helai dalam heliks ganda DNA pada suhu tinggi dalam proses yang disebut DNA mencair. Pada suhu yang lebih rendah, masing-masing untai ini kemudian digunakan sebagai template dalam sintesis DNA oleh polimerase DNA untuk selektif memperkuat DNA target.Selektivitas hasil PCR dari penggunaan primer yang komplementer ke wilayah yang ditargetkan untuk amplifikasi DNA di bawah kondisi spesifik siklus termal.
Menempatkan strip delapan tabung PCR, masing-masing berisi 100 ml campuran reaksi, ke dalam mesin PCR
PCR prinsip-prinsip dan prosedur
Gambar 1a: Sebuah pengendara sepeda termal untuk PCR
Gambar 1b: Sebuah model yang lebih tua tiga pengendara sepeda suhu termal untuk PCR
PCR digunakan untuk memperkuat wilayah tertentu dari sebuah untai DNA (DNA target). Sebagian besar metode PCR biasanya memperkuat fragmen DNA hingga ~ 10 kilo pasangan basa (kb), meskipun beberapa teknik memungkinkan untuk amplifikasi fragmen hingga 40 kb dalam ukuran .
PCR dasar yang ditetapkan up membutuhkan beberapa komponen dan reagen Komponen-komponen ini meliputi.:
DNA template yang berisi wilayah DNA (target) yang akan diperkuat.
Dua primer yang komplementer terhadap 3 '(tiga perdana) ujung masing-masing untai sense dan anti-rasa target DNA.
Taq polimerase atau lain polimerase DNA dengan suhu optimal di sekitar 70 ° C.
Deoxynucleoside trifosfat (dNTP; nukleotida yang mengandung kelompok triphosphate), bangunan-blok dari mana DNA polimerase mensintesis untai DNA baru.
Buffer solusi, menyediakan lingkungan kimia yang cocok untuk aktivitas optimal dan stabilitas DNA polimerase.
Kation divalen, magnesium atau ion mangan, umumnya Mg2 + digunakan, tetapi Mn2 + dapat digunakan untuk PCR-DNA dimediasi mutagenesis, seperti Mn2 + konsentrasi yang lebih tinggi meningkatkan tingkat kesalahan selama sintesis DNA
Kation kalium ion monovalen.
PCR umumnya dilakukan dalam volume 10-200 ml reaksi dalam tabung reaksi kecil (0,2-0,5 ml volume) dalam sebuah pengendara sepeda termal. Para pengendara sepeda termal memanaskan dan mendinginkan tabung reaksi untuk mencapai suhu yang diperlukan pada setiap langkah reaksi (lihat di bawah). Banyak cyclers termal modern yang memanfaatkan efek Peltier, yang memungkinkan baik pemanasan dan pendinginan blok memegang tabung PCR hanya dengan membalikkan arus listrik. Berdinding tipis tabung reaksi ijin konduktivitas termal yang menguntungkan untuk memungkinkan equilibrium termal cepat. Kebanyakan cyclers termal memiliki kelopak dipanaskan untuk mencegah kondensasi di bagian atas tabung reaksi.Thermocyclers lama tidak memiliki tutup dipanaskan memerlukan lapisan minyak di atas campuran reaksi atau bola dari lilin di dalam tabung.
Prosedur
Gambar 2: Skema gambar dari siklus PCR. (1) denaturasi pada 94-96 ° C. (2) Annealing pada ~ 65 ° C (3) Pemanjangan pada 72 ° C Empat siklus yang ditampilkan di sini. Garis biru mewakili template DNA yang primer (merah panah) anil yang diperpanjang oleh DNA polimerase (lingkaran hijau muda), untuk memberikan produk DNA pendek (garis hijau), yang sendiri digunakan sebagai template sebagai PCR berlangsung.
Biasanya, PCR terdiri dari serangkaian perubahan suhu 20-40 berulang, disebut siklus, dengan masing-masing siklus terdiri dari 2-3 biasanya suhu langkah diskrit, biasanya tiga (Gambar 2). Bersepeda ini seringkali diawali oleh satu langkah temperatur tunggal (disebut ditahan) pada suhu tinggi (> 90 ° C), dan diikuti oleh satu terus di akhir perpanjangan produk akhir atau penyimpanan singkat. Suhu yang digunakan dan lamanya waktu mereka diterapkan pada setiap siklus tergantung pada berbagai parameter. Ini termasuk enzim yang digunakan untuk sintesis DNA, konsentrasi ion divalen dan dNTP dalam reaksi, dan suhu leleh (Tm) dari primer.
Langkah inisialisasi: Langkah ini terdiri dari pemanasan reaksi sampai suhu 94-96 ° C (atau 98 ° C jika polimerase termostabil yang digunakan sangat), yang diadakan untuk 1-9 menit. Hal ini hanya diperlukan untuk polimerase DNA yang membutuhkan aktivasi panas dengan panas mulai PCR.
Langkah denaturasi: Langkah ini merupakan acara rutin bersepeda pertama dan terdiri dari pemanasan reaksi untuk 94-98 ° C selama 20-30 detik. Hal ini menyebabkan leleh DNA dari template DNA oleh mengganggu ikatan hidrogen antara basa komplementer, menghasilkan beruntai tunggal molekul DNA.
Annealing langkah: Suhu reaksi diturunkan sampai 50-65 ° C selama 20-40 detik memungkinkan anil primer ke template DNA untai tunggal. Biasanya suhu anil adalah sekitar 3-5 derajat Celcius di bawah Tm dari primer yang digunakan. Stabil DNA-DNA ikatan hidrogen hanya terbentuk ketika urutan primer sangat erat sesuai urutan template. Polimerase mengikat hibrida primer-template dan mulai sintesis DNA.
Perpanjangan / elongasi langkah: Suhu pada langkah ini tergantung pada polimerase DNA yang digunakan; polimerase Taq memiliki suhu aktivitas optimum pada 75-80 ° C, dan umumnya suhu 72 ° C digunakan dengan enzim ini .Pada langkah ini mensintesis DNA polimerase untai DNA baru melengkapi untai DNA cetakan dengan menambahkan dNTP yang melengkapi template dalam 5 'ke 3' arah, kondensasi gugus 5'-fosfat dari dNTP dengan hidroksil 3'- kelompok di akhir untai (memperpanjang) DNA baru lahir. Waktu perpanjangan tergantung baik pada DNA polimerase yang digunakan dan pada panjang fragmen DNA yang akan diamplifikasi. Sebagai aturan-of-thumb, pada suhu optimal, DNA polimerase akan mempolimerisasi seribu basis per menit. Dalam kondisi optimal, yaitu, jika tidak ada keterbatasan karena membatasi substrat atau reagen, di setiap langkah ekstensi, jumlah target DNA dua kali lipat, yang mengarah ke eksponensial (geometris) amplifikasi fragmen DNA spesifik.
Elongasi akhir: Ini langkah tunggal kadang-kadang dilakukan pada suhu 70-74 ° C selama 5-15 menit setelah siklus PCR terakhir untuk memastikan bahwa setiap DNA untai tunggal yang tersisa sepenuhnya diperpanjang.
Akhir terus: Ini langkah pada 4-15 ° C untuk waktu yang terbatas dapat digunakan untuk penyimpanan jangka pendek reaksi.
Gambar 3: etidium bromida bernoda PCR produk setelah elektroforesis gel. Dua set primer digunakan untuk memperkuat urutan target dari tiga sampel jaringan yang berbeda. Tidak ada amplifikasi hadir dalam sampel # 1; DNA sampel band di # 2 dan # 3 menunjukkan keberhasilan amplifikasi urutan target. Gel juga menunjukkan kontrol positif, dan sebuah tangga DNA yang mengandung fragmen DNA panjang yang ditetapkan untuk ukuran band-band di PCR eksperimental.
Untuk memeriksa apakah PCR dihasilkan fragmen DNA diantisipasi (juga kadang-kadang disebut sebagai amplimer atau amplikon), elektroforesis gel agarosa digunakan untuk pemisahan ukuran produk PCR. Ukuran (s) produk PCR ditentukan oleh perbandingan dengan sebuah tangga DNA (penanda berat molekul), yang berisi fragmen DNA ukuran yang dikenal, berjalan di samping gel produk PCR (lihat Gambar. 3).
PCR tahap
Proses PCR dapat dibagi menjadi tiga tahap:
Amplifikasi Eksponensial: Pada setiap siklus, jumlah produk adalah dua kali lipat (dengan asumsi efisiensi 100% reaksi). Reaksi ini sangat sensitif: jumlah menit DNA hanya perlu hadir [12].
Leveling dari panggung: Reaksi melambat sebagai DNA polimerase kehilangan aktivitas dan sebagai konsumsi reagen seperti dNTP dan primer menyebabkan mereka menjadi pembatas.
Dataran Tinggi: Tidak ada produk yang lebih menumpuk karena kelelahan reagen dan enzim.
optimasi PCR
Artikel utama: optimasi PCR
Dalam prakteknya, PCR dapat gagal karena berbagai alasan, sebagian karena kepekaan terhadap kontaminasi amplifikasi DNA menyebabkan produk palsu.Karena itu, sejumlah teknik dan prosedur telah dikembangkan untuk mengoptimalkan kondisi PCR. Kontaminasi dengan DNA asing ditujukan dengan protokol dan prosedur laboratorium yang memisahkan pra-PCR campuran dari kontaminan DNA potensial . Ini biasanya melibatkan pemisahan spasial PCR-setup daerah dari daerah untuk analisis atau pemurnian produk PCR, penggunaan Plasticware sekali pakai, dan secara menyeluruh membersihkan permukaan kerja antara setup reaksi. Primer-desain teknik yang penting dalam meningkatkan hasil produk PCR dan dalam menghindari pembentukan produk palsu, dan penggunaan komponen penyangga alternatif atau enzim polimerase dapat membantu dengan amplifikasi daerah panjang atau sebaliknya bermasalah DNA. Penambahan reagen, seperti formamida, dalam sistem penyangga dapat meningkatkan spesifisitas dan hasil PCR.
Aplikasi PCR
Artikel utama: Aplikasi PCR
isolasi DNA Selektif
PCR memungkinkan isolasi fragmen DNA dari DNA genomik oleh amplifikasi selektif dari suatu wilayah tertentu dari DNA. Ini menggunakan metode PCR menambah banyak, seperti menghasilkan probe hibridisasi Southern hybridization atau utara dan kloning DNA, yang memerlukan sejumlah besar DNA, yang mewakili wilayah DNA spesifik. PCR pasokan teknik ini dengan jumlah yang tinggi DNA murni, memungkinkan analisis sampel DNA bahkan dari jumlah yang sangat kecil dari bahan awal. [Kutipan diperlukan]
Aplikasi lain dari PCR termasuk sekuensing DNA untuk menentukan diketahui PCR-diperkuat urutan di mana salah satu primer amplifikasi dapat digunakan dalam sekuensing Sanger, isolasi dari urutan DNA untuk mempercepat teknologi DNA rekombinan yang melibatkan penyisipan DNA ke dalam urutan plasmid ataubahan genetik organisme lain. Koloni bakteri (E. coli) dapat cepat disaring oleh PCR untuk konstruksi vektor DNA yang benar PCR juga dapat digunakan untuk sidik jari genetik;. Teknik forensik digunakan untuk mengidentifikasi seseorang atau organisme dengan membandingkan DNA melalui berbagai eksperimen PCR berbasis metode [kutipan diperlukan].
Metode 'sidik jari' beberapa PCR memiliki kekuatan diskriminatif yang tinggi dan dapat digunakan untuk mengidentifikasi hubungan genetik antara individu, seperti orang tua-anak atau antara saudara kandung, dan digunakan dalam pengujian paternitas (Gambar 4). Teknik ini juga dapat digunakan untuk menentukan hubungan evolusioner antara organisme [kutipan diperlukan].
Gambar 4: Elektroforesis dari PCR diamplifikasi fragmen DNA. (1) Bapa. (2) Anak.(3) Ibu. Anak telah mewarisi beberapa, tapi tidak semua sidik jari dari setiap orang tua, memberikan sidik jari, baru yang unik.
Amplifikasi dan kuantifikasi DNA
Karena PCR menguatkan daerah DNA yang target, PCR dapat digunakan untuk menganalisa jumlah yang sangat kecil sampel. Hal ini sering penting untuk analisis forensik, ketika hanya sejumlah jejak DNA tersedia sebagai bukti. PCR juga dapat digunakan dalam analisis DNA kuno yang puluhan ribu tahun. Ini berbasis teknik PCR telah berhasil digunakan pada hewan, seperti empat puluh ribu tahun raksasa, dan juga pada DNA manusia, dalam aplikasi mulai dari analisis mumi Mesir untuk identifikasi dari Tsar Rusia.
Metode PCR kuantitatif memungkinkan estimasi dari jumlah urutan yang diberikan hadir dalam teknik sampel-sering diterapkan pada kuantitatif menentukan tingkat ekspresi gen. Real-time PCR adalah alat yang didirikan untuk kuantifikasi DNA yang mengukur akumulasi produk DNA setelah setiap putaran amplifikasi PCR.
Lihat juga Penggunaan DNA dalam forensik entomologi
PCR dalam diagnosis penyakit
PCR memungkinkan diagnosis dini penyakit ganas seperti leukemia dan limfoma, yang saat ini tertinggi yang dikembangkan dalam penelitian kanker dan sudah digunakan secara rutin. (Lihat studi yang dikutip dalam EUTOS Untuk artikel studi CML di http://www.eutos.org/content/molecular_monitoring/information/pcr_testing/, terutama catatan 10-13.) PCR dapat dilakukan langsung pada sampel DNA genom untuk mendeteksi translokasi-spesifik sel-sel ganas pada sensitivitas yang setidaknya 10.000 kali lipat lebih tinggi daripada metode lain [rujukan?].
PCR juga memungkinkan identifikasi mikroorganisme non-cultivatable atau lambat tumbuh seperti mikobakteri, bakteri anaerob, atau virus dari tes kultur jaringan dan model hewan. Dasar untuk aplikasi PCR diagnostik dalam mikrobiologi adalah deteksi agen infeksi dan diskriminasi non-patogen dari strain patogen berdasarkan gen-gen tertentu.
DNA virus juga dapat dideteksi dengan PCR. Primer yang digunakan harus spesifik ke urutan ditargetkan dalam DNA virus, dan PCR dapat digunakan untuk analisis diagnostik atau DNA sekuensing dari genom virus. Sensitivitas tinggi PCR memungkinkan pendeteksian virus segera setelah infeksi dan bahkan sebelum timbulnya penyakit. Deteksi dini tersebut dapat memberikan dokter memimpin signifikan dalam pengobatan. Jumlah virus ("viral load") pada pasien juga dapat diukur dengan PCR DNA berbasis teknik kuantisasi (lihat di bawah).
Variasi pada teknik PCR dasar
Artikel utama: Varian PCR
Alel spesifik PCR: teknik diagnostik atau kloning berdasarkan polimorfisme nukleotida tunggal (SNP) (tunggal-basis perbedaan dalam DNA). Hal ini membutuhkan pengetahuan sebelumnya dari urutan DNA, termasuk perbedaan antara alel, dan menggunakan primer yang 3 'berakhir mencakup SNP. Amplifikasi PCR dalam kondisi ketat jauh kurang efisien dalam adanya ketidaksesuaian antara template dan primer, amplifikasi begitu sukses dengan kehadiran SNP primer spesifik sinyal dari SNP tertentu dalam urutan Lihat SNP genotyping untuk informasi lebih lanjut..
PCR atau Polymerase Majelis Majelis Bersepeda (PCA): sintesis buatan dari sekuens DNA yang panjang dengan melakukan PCR pada kolam oligonukleotida panjang dengan segmen yang tumpang tindih pendek. Oligonukleotida bergantian antara akal dan arah antisense, dan segmen yang tumpang tindih menentukan urutan fragmen PCR, sehingga selektif memproduksi produk DNA akhir panjang.
Asimetris PCR: preferentially menguatkan satu untai DNA dalam template DNA beruntai ganda. Hal ini digunakan dalam sequencing dan hibridisasi menyelidik di mana amplifikasi hanya satu dari dua untai komplementer diperlukan. PCR dilakukan seperti biasa, tapi dengan kelebihan besar dari primer untuk untai ditargetkan untuk amplifikasi. Karena amplifikasi (aritmatika) yang lambat kemudian dalam reaksi setelah membatasi primer telah digunakan sampai, siklus ekstra PCR dibutuhkan Sebuah modifikasi baru pada proses ini, yang dikenal sebagai Linear-Setelah-The-Eksponensial-PCR. ( TERLAMBAT-PCR), menggunakan primer membatasi dengan suhu leleh yang lebih tinggi (Tm) dari primer kelebihan untuk mempertahankan efisiensi reaksi sebagai konsentrasi primer membatasi menurun pertengahan reaksi.
Helikase tergantung amplifikasi: mirip dengan PCR tradisional, tetapi menggunakan suhu konstan daripada bersepeda melalui denaturasi dan anil / siklus ekstensi. DNA helikase, enzim yang unwinds DNA, digunakan di tempat denaturasi termal.
Hot mulai PCR: suatu teknik yang mengurangi non-spesifik amplifikasi selama set up awal tahapan PCR. Ini dapat dilakukan secara manual dengan memanaskan komponen reaksi suhu denaturasi (misalnya, 95 ° C) sebelum menambahkan polimerase . Sistem enzim khusus telah dikembangkan yang menghambat aktivitas polimerase pada suhu ambien, baik oleh pengikatan suatu antibodi atau oleh kehadiran inhibitor yang terikat kovalen yang terdisosiasi setelah langkah aktivasi suhu-tinggi. Hot-start/cold-finish PCR dicapai dengan polimerase hibrida baru yang sudah tidak aktif pada suhu ambien dan langsung diaktifkan pada suhu perpanjangan.
Intersequence khusus PCR (ISSR):. Metode PCR untuk DNA fingerprinting yang menguatkan wilayah antara mengulangi urutan sederhana untuk menghasilkan sidik jari unik dari panjang fragmen diamplifikasi
Invers PCR: umumnya digunakan untuk mengidentifikasi urutan genom mengapit sekitar sisipan. Ini melibatkan serangkaian pencernaan DNA dan ligasi diri, sehingga urutan dikenal di kedua ujung dari urutan yang tidak diketahui.
Ligasi-dimediasi PCR: menggunakan linker DNA kecil diikat dengan DNA kepentingan dan beberapa primer anil ke linker DNA, telah digunakan untuk sekuensing DNA, berjalan genom, dan footprinting DNA .
Metilasi khusus PCR (MSP): dikembangkan oleh Stephen Baylin dan Jim Herman di Johns Hopkins School of Medicine, dan digunakan untuk mendeteksi metilasi pulau CpG dalam DNA genomik. DNA pertama kali diobati dengan natrium bisulfit, yang mengubah basis unmethylated sitosin ke urasil, yang diakui oleh PCR primer sebagai timin. Dua PCR kemudian dilakukan pada DNA dimodifikasi, menggunakan primer set identik kecuali pada setiap pulau CpG dalam urutan primer. Pada titik-titik, satu set primer DNA dengan sitosin mengakui untuk memperkuat DNA alkohol, dan satu set mengakui DNA dengan urasil atau timin untuk memperkuat DNA unmethylated. MSP qPCR menggunakan juga dapat dilakukan untuk mendapatkan kuantitatif daripada informasi kualitatif tentang metilasi.
Miniprimer PCR: menggunakan polimerase termostabil (S-TBR) yang dapat diperluas dari primer pendek ("smalligos") sesingkat 9 atau 10 nukleotida. Metode ini memungkinkan PCR menargetkan untuk wilayah primer lebih kecil mengikat, dan digunakan untuk memperkuat urutan DNA dilestarikan, seperti gen 16S rRNA (atau 18S eukariotik) .
Multiplex Ligasi-tergantung Probe Amplifikasi (MLPA): memungkinkan beberapa sasaran harus diperkuat dengan hanya sepasang primer tunggal, sehingga menghindari keterbatasan resolusi dari multipleks PCR (lihat di bawah).
Multiplex-PCR: terdiri dari beberapa set primer dalam campuran PCR tunggal untuk menghasilkan amplikon dari berbagai ukuran yang spesifik untuk sekuens DNA yang berbeda. Dengan penargetan gen sekaligus, informasi tambahan dapat diperoleh dari satu tes yang dijalankan yang tidak akan membutuhkan beberapa kali reagen dan lebih banyak waktu untuk melakukan. Temperatur anil untuk masing-masing set primer harus dioptimalkan untuk bekerja dengan benar dalam reaksi tunggal, dan ukuran amplikon. Artinya, basis panjang pasangan mereka harus cukup berbeda untuk membentuk band yang berbeda ketika divisualisasikan dengan elektroforesis gel.
PCR nested: meningkatkan spesifisitas amplifikasi DNA, dengan mengurangi latar belakang karena non-spesifik amplifikasi DNA. Dua set primer yang digunakan dalam dua PCR berturut-turut. Dalam reaksi pertama, sepasang primer yang digunakan untuk menghasilkan produk DNA, yang selain sasaran yang dituju, masih dapat terdiri dari non-spesifik fragmen DNA diamplifikasi. Produk (s) yang kemudian digunakan dalam PCR kedua dengan satu set primer yang mengikat situs yang sepenuhnya atau sebagian berbeda dari dan terletak 3 'dari tiap primer yang digunakan dalam reaksi pertama. PCR nested sering lebih berhasil dalam memperkuat fragmen DNA spesifik panjang daripada PCR konvensional, tetapi membutuhkan pengetahuan lebih rinci tentang urutan target.
Tumpang tindih-ekstensi PCR atau Penyambungan dengan ekstensi tumpang tindih (BUMN): teknik rekayasa genetika yang digunakan untuk sambatan bersama-sama fragmen DNA dua atau lebih yang mengandung urutan komplementer. Hal ini digunakan untuk bergabung potongan DNA yang mengandung gen, urutan peraturan, atau mutasi, teknik ini memungkinkan penciptaan konstruksi DNA spesifik dan panjang.
PCR kuantitatif (Q-PCR): digunakan untuk mengukur kuantitas produk PCR (umumnya secara real-time). Ini kuantitatif mengukur jumlah awal DNA, cDNA, atau RNA. Q-PCR umumnya digunakan untuk menentukan apakah urutan DNA hadir dalam sampel dan jumlah salinan dalam sampel. Kuantitatif real-time PCR memiliki tingkat yang sangat presisi yang tinggi. QRT-PCR (atau QF-PCR) metode menggunakan pewarna fluorescent, seperti Sybr Hijau, EvaGreen atau probe DNA yang mengandung fluorophore, seperti TaqMan, untuk mengukur jumlah produk diperkuat secara real time. Hal ini juga kadang-kadang disingkat RT-PCR (Real Time PCR) atau RQ-PCR. QRT-PCR atau RTQ-PCR kontraksi lebih tepat, karena RT-PCR umumnya mengacu pada transkripsi balik PCR (lihat di bawah), sering digunakan dalam hubungannya dengan Q-PCR.
Transkripsi sebaliknya PCR (RT-PCR): untuk memperkuat DNA dari RNA. Reverse reverse transcriptase mentranskripsi RNA menjadi cDNA, yang kemudian diperkuat dengan PCR. RT-PCR secara luas digunakan dalam profil ekspresi, untuk menentukan ekspresi gen atau untuk mengidentifikasi urutan dari transkrip RNA, termasuk start transkripsi dan situs terminasi. Jika urutan DNA genomik gen diketahui, RT-PCR dapat digunakan untuk memetakan lokasi ekson dan intron dalam gen. Ujung 5 'dari gen (sesuai dengan situs awal transkripsi) biasanya diidentifikasi oleh RACE-PCR (Amplifikasi cDNA Berakhir Cepat).
Fase padat PCR: mencakup beberapa arti, termasuk Amplifikasi Polony (di mana koloni PCR diturunkan dalam matriks gel, misalnya), Jembatan PCR (primer yang kovalen terkait dengan permukaan padat-dukungan), Fase Padat PCR konvensional (di mana PCR asimetris diterapkan di hadapan primer bantalan dukungan solid dengan urutan pencocokan salah satu primer berair) dan Fase Padat Peningkatan PCR (di mana Fase Padat PCR konvensional dapat ditingkatkan dengan menggunakan Tm tinggi dan bersarang primer dukungan yang solid dengan aplikasi opsional dari 'langkah' termal untuk mendukung priming dukungan yang solid).
Termal interlaced PCR asimetris (TAIL-PCR): untuk isolasi dari urutan diketahui mengapit urutan yang dikenal. Dalam urutan yang dikenal, TAIL-PCR menggunakan sepasang bersarang primer dengan berbeda suhu anil; primer merosot digunakan untuk memperkuat ke arah lain dari urutan yang tidak diketahui .
Touchdown PCR (PCR Langkah-down): sebuah varian dari PCR yang bertujuan untuk mengurangi latar belakang spesifik dengan secara bertahap menurunkan suhu annealing PCR bersepeda sebagai berlangsung. Suhu anil pada siklus awal biasanya beberapa derajat (3-5 ° C) di atas Tm dari primer yang digunakan, sedangkan pada siklus selanjutnya, itu adalah beberapa derajat (3-5 ° C) di bawah primer Tm. Suhu yang lebih tinggi memberikan spesifisitas yang lebih besar untuk mengikat primer, dan suhu yang lebih rendah memungkinkan amplifikasi lebih efisien dari produk tertentu yang terbentuk selama siklus awal .
PAN-AC: menggunakan kondisi isotermal untuk amplifikasi, dan dapat digunakan dalam sel hidup .
Berjalan Cepat Universal: untuk berjalan genom dan sidik jari genetik menggunakan lebih spesifik 'dua sisi' PCR dari konvensional 'satu sisi' pendekatan (hanya menggunakan satu gen spesifik primer dan satu primer umum - yang dapat menyebabkan artefactual 'kebisingan') berdasarkan mekanisme yang melibatkan pembentukan struktur tali penjerat ternak. Derivatif streamline UFW adalah Lane RAGE (menjerat tergantung PCR nested untuk amplifikasi cepat berakhir DNA genom), 5'RACE Lane dan 3'RACE Lane .
Sejarah
Artikel utama: Sejarah reaksi berantai polimerase
Sebuah kertas 1971 di Journal of Molecular Biology oleh Kleppe dan rekan kerja pertama kali menggambarkan sebuah metode menggunakan assay enzimatik untuk mereplikasi DNA pendek template dengan primer secara in vitro Namun., Ini manifestasi awal dari prinsip PCR dasar tidak menerima banyak perhatian, dan penemuan reaksi berantai polimerase pada tahun 1983 umumnya Kary Mullis dikreditkan ke.
Ketika Mullis mengembangkan PCR pada tahun 1983, dia bekerja di Emeryville, California untuk Cetus Corporation, salah satu perusahaan bioteknologi pertama.Di sana, dia bertanggung jawab untuk sintesis DNA rantai pendek. Mullis telah menulis bahwa ia dikandung PCR sambil meluncur di sepanjang Pacific Coast Highway satu malam di dalam mobil . Dia sedang bermain dalam pikirannya dengan cara baru menganalisis perubahan (mutasi) dalam DNA ketika ia menyadari bahwa ia bukan diciptakan metode memperkuat setiap daerah DNA melalui siklus berulang duplikasi didorong oleh DNA polimerase. Dalam Scientific American, Mullis prosedur diringkas: "Dimulai dengan satu molekul DNA bahan genetik, PCR dapat menghasilkan 100 miliar molekul serupa di sore reaksi ini mudah untuk melaksanakan ini membutuhkan tidak lebih dari sebuah tabung uji,..reagen sederhana, dan sumber panas. " Dia dianugerahi Penghargaan Nobel dalam Kimia pada tahun 1993 untuk penemuan, tujuh tahun setelah ia dan rekan-rekannya di Cetus pertama kali proposal untuk berlatih. Namun, beberapa kontroversi tetap tentang kontribusi intelektual dan praktis dari ilmuwan lain untuk bekerja Mullis ', dan apakah ia telah penemu tunggal prinsip PCR (lihat di bawah).
Pada inti dari metode PCR adalah penggunaan DNA polimerase yang cocok mampu menahan suhu tinggi> 90 ° C (194 ° F) diperlukan untuk pemisahan dari dua untai DNA dalam heliks ganda DNA setelah setiap siklus replikasi. DNA polimerase awalnya digunakan dalam percobaan in vitro presaging PCR tidak mampu menahan suhu tinggi ini Jadi prosedur awal untuk replikasi DNA sangat memakan waktu dan tidak efisien, dan jumlah besar diperlukan DNA polimerase dan penanganan kontinyu sepanjang proses..
Penemuan pada tahun 1976 polimerase Taq - polimerase DNA dimurnikan dari bakteri termofilik, aquaticus Thermus, yang secara alami hidup di panas (50 sampai 80 ° C (122-176 ° F)) lingkungan seperti sumber air panas - yang beraspal jalan bagi perbaikan dramatis dari metode PCR. DNA polimerase terisolasi dari T. aquaticus stabil pada suhu tinggi tetap aktif bahkan setelah denaturasi DNA, sehingga menghindarkan kebutuhan untuk menambahkan polimerase DNA baru setelah setiap siklus. Hal ini memungkinkan sebuah thermocycler otomatis berbasis proses amplifikasi DNA .
Paten perang
Teknik PCR Kary Mullis dipatenkan oleh dan ditugaskan untuk Cetus Corporation, di mana Mullis bekerja ketika ia menemukan teknik ini pada tahun 1983. Taq polimerase enzim ini juga diliput oleh paten. Ada beberapa profil tinggi tuntutan hukum yang berhubungan dengan teknik, termasuk gugatan tidak berhasil dibawa oleh DuPont. Perusahaan farmasi Hoffmann-La Roche membeli hak atas paten pada tahun 1992 dan saat ini memegang mereka yang masih dilindungi.
Sebuah pertempuran paten terkait selama enzim polimerase Taq masih berlangsung di beberapa yurisdiksi di seluruh dunia antara Roche dan Promega.Argumen-argumen hukum yang melampaui kehidupan PCR asli dan paten polimerase Taq, yang berakhir pada tanggal 28 Maret 2005.
Menempatkan strip delapan tabung PCR, masing-masing berisi 100 ml campuran reaksi, ke dalam mesin PCR
PCR prinsip-prinsip dan prosedur
Gambar 1a: Sebuah pengendara sepeda termal untuk PCR
Gambar 1b: Sebuah model yang lebih tua tiga pengendara sepeda suhu termal untuk PCR
PCR digunakan untuk memperkuat wilayah tertentu dari sebuah untai DNA (DNA target). Sebagian besar metode PCR biasanya memperkuat fragmen DNA hingga ~ 10 kilo pasangan basa (kb), meskipun beberapa teknik memungkinkan untuk amplifikasi fragmen hingga 40 kb dalam ukuran .
PCR dasar yang ditetapkan up membutuhkan beberapa komponen dan reagen Komponen-komponen ini meliputi.:
DNA template yang berisi wilayah DNA (target) yang akan diperkuat.
Dua primer yang komplementer terhadap 3 '(tiga perdana) ujung masing-masing untai sense dan anti-rasa target DNA.
Taq polimerase atau lain polimerase DNA dengan suhu optimal di sekitar 70 ° C.
Deoxynucleoside trifosfat (dNTP; nukleotida yang mengandung kelompok triphosphate), bangunan-blok dari mana DNA polimerase mensintesis untai DNA baru.
Buffer solusi, menyediakan lingkungan kimia yang cocok untuk aktivitas optimal dan stabilitas DNA polimerase.
Kation divalen, magnesium atau ion mangan, umumnya Mg2 + digunakan, tetapi Mn2 + dapat digunakan untuk PCR-DNA dimediasi mutagenesis, seperti Mn2 + konsentrasi yang lebih tinggi meningkatkan tingkat kesalahan selama sintesis DNA
Kation kalium ion monovalen.
PCR umumnya dilakukan dalam volume 10-200 ml reaksi dalam tabung reaksi kecil (0,2-0,5 ml volume) dalam sebuah pengendara sepeda termal. Para pengendara sepeda termal memanaskan dan mendinginkan tabung reaksi untuk mencapai suhu yang diperlukan pada setiap langkah reaksi (lihat di bawah). Banyak cyclers termal modern yang memanfaatkan efek Peltier, yang memungkinkan baik pemanasan dan pendinginan blok memegang tabung PCR hanya dengan membalikkan arus listrik. Berdinding tipis tabung reaksi ijin konduktivitas termal yang menguntungkan untuk memungkinkan equilibrium termal cepat. Kebanyakan cyclers termal memiliki kelopak dipanaskan untuk mencegah kondensasi di bagian atas tabung reaksi.Thermocyclers lama tidak memiliki tutup dipanaskan memerlukan lapisan minyak di atas campuran reaksi atau bola dari lilin di dalam tabung.
Prosedur
Gambar 2: Skema gambar dari siklus PCR. (1) denaturasi pada 94-96 ° C. (2) Annealing pada ~ 65 ° C (3) Pemanjangan pada 72 ° C Empat siklus yang ditampilkan di sini. Garis biru mewakili template DNA yang primer (merah panah) anil yang diperpanjang oleh DNA polimerase (lingkaran hijau muda), untuk memberikan produk DNA pendek (garis hijau), yang sendiri digunakan sebagai template sebagai PCR berlangsung.
Biasanya, PCR terdiri dari serangkaian perubahan suhu 20-40 berulang, disebut siklus, dengan masing-masing siklus terdiri dari 2-3 biasanya suhu langkah diskrit, biasanya tiga (Gambar 2). Bersepeda ini seringkali diawali oleh satu langkah temperatur tunggal (disebut ditahan) pada suhu tinggi (> 90 ° C), dan diikuti oleh satu terus di akhir perpanjangan produk akhir atau penyimpanan singkat. Suhu yang digunakan dan lamanya waktu mereka diterapkan pada setiap siklus tergantung pada berbagai parameter. Ini termasuk enzim yang digunakan untuk sintesis DNA, konsentrasi ion divalen dan dNTP dalam reaksi, dan suhu leleh (Tm) dari primer.
Langkah inisialisasi: Langkah ini terdiri dari pemanasan reaksi sampai suhu 94-96 ° C (atau 98 ° C jika polimerase termostabil yang digunakan sangat), yang diadakan untuk 1-9 menit. Hal ini hanya diperlukan untuk polimerase DNA yang membutuhkan aktivasi panas dengan panas mulai PCR.
Langkah denaturasi: Langkah ini merupakan acara rutin bersepeda pertama dan terdiri dari pemanasan reaksi untuk 94-98 ° C selama 20-30 detik. Hal ini menyebabkan leleh DNA dari template DNA oleh mengganggu ikatan hidrogen antara basa komplementer, menghasilkan beruntai tunggal molekul DNA.
Annealing langkah: Suhu reaksi diturunkan sampai 50-65 ° C selama 20-40 detik memungkinkan anil primer ke template DNA untai tunggal. Biasanya suhu anil adalah sekitar 3-5 derajat Celcius di bawah Tm dari primer yang digunakan. Stabil DNA-DNA ikatan hidrogen hanya terbentuk ketika urutan primer sangat erat sesuai urutan template. Polimerase mengikat hibrida primer-template dan mulai sintesis DNA.
Perpanjangan / elongasi langkah: Suhu pada langkah ini tergantung pada polimerase DNA yang digunakan; polimerase Taq memiliki suhu aktivitas optimum pada 75-80 ° C, dan umumnya suhu 72 ° C digunakan dengan enzim ini .Pada langkah ini mensintesis DNA polimerase untai DNA baru melengkapi untai DNA cetakan dengan menambahkan dNTP yang melengkapi template dalam 5 'ke 3' arah, kondensasi gugus 5'-fosfat dari dNTP dengan hidroksil 3'- kelompok di akhir untai (memperpanjang) DNA baru lahir. Waktu perpanjangan tergantung baik pada DNA polimerase yang digunakan dan pada panjang fragmen DNA yang akan diamplifikasi. Sebagai aturan-of-thumb, pada suhu optimal, DNA polimerase akan mempolimerisasi seribu basis per menit. Dalam kondisi optimal, yaitu, jika tidak ada keterbatasan karena membatasi substrat atau reagen, di setiap langkah ekstensi, jumlah target DNA dua kali lipat, yang mengarah ke eksponensial (geometris) amplifikasi fragmen DNA spesifik.
Elongasi akhir: Ini langkah tunggal kadang-kadang dilakukan pada suhu 70-74 ° C selama 5-15 menit setelah siklus PCR terakhir untuk memastikan bahwa setiap DNA untai tunggal yang tersisa sepenuhnya diperpanjang.
Akhir terus: Ini langkah pada 4-15 ° C untuk waktu yang terbatas dapat digunakan untuk penyimpanan jangka pendek reaksi.
Gambar 3: etidium bromida bernoda PCR produk setelah elektroforesis gel. Dua set primer digunakan untuk memperkuat urutan target dari tiga sampel jaringan yang berbeda. Tidak ada amplifikasi hadir dalam sampel # 1; DNA sampel band di # 2 dan # 3 menunjukkan keberhasilan amplifikasi urutan target. Gel juga menunjukkan kontrol positif, dan sebuah tangga DNA yang mengandung fragmen DNA panjang yang ditetapkan untuk ukuran band-band di PCR eksperimental.
Untuk memeriksa apakah PCR dihasilkan fragmen DNA diantisipasi (juga kadang-kadang disebut sebagai amplimer atau amplikon), elektroforesis gel agarosa digunakan untuk pemisahan ukuran produk PCR. Ukuran (s) produk PCR ditentukan oleh perbandingan dengan sebuah tangga DNA (penanda berat molekul), yang berisi fragmen DNA ukuran yang dikenal, berjalan di samping gel produk PCR (lihat Gambar. 3).
PCR tahap
Proses PCR dapat dibagi menjadi tiga tahap:
Amplifikasi Eksponensial: Pada setiap siklus, jumlah produk adalah dua kali lipat (dengan asumsi efisiensi 100% reaksi). Reaksi ini sangat sensitif: jumlah menit DNA hanya perlu hadir [12].
Leveling dari panggung: Reaksi melambat sebagai DNA polimerase kehilangan aktivitas dan sebagai konsumsi reagen seperti dNTP dan primer menyebabkan mereka menjadi pembatas.
Dataran Tinggi: Tidak ada produk yang lebih menumpuk karena kelelahan reagen dan enzim.
optimasi PCR
Artikel utama: optimasi PCR
Dalam prakteknya, PCR dapat gagal karena berbagai alasan, sebagian karena kepekaan terhadap kontaminasi amplifikasi DNA menyebabkan produk palsu.Karena itu, sejumlah teknik dan prosedur telah dikembangkan untuk mengoptimalkan kondisi PCR. Kontaminasi dengan DNA asing ditujukan dengan protokol dan prosedur laboratorium yang memisahkan pra-PCR campuran dari kontaminan DNA potensial . Ini biasanya melibatkan pemisahan spasial PCR-setup daerah dari daerah untuk analisis atau pemurnian produk PCR, penggunaan Plasticware sekali pakai, dan secara menyeluruh membersihkan permukaan kerja antara setup reaksi. Primer-desain teknik yang penting dalam meningkatkan hasil produk PCR dan dalam menghindari pembentukan produk palsu, dan penggunaan komponen penyangga alternatif atau enzim polimerase dapat membantu dengan amplifikasi daerah panjang atau sebaliknya bermasalah DNA. Penambahan reagen, seperti formamida, dalam sistem penyangga dapat meningkatkan spesifisitas dan hasil PCR.
Aplikasi PCR
Artikel utama: Aplikasi PCR
isolasi DNA Selektif
PCR memungkinkan isolasi fragmen DNA dari DNA genomik oleh amplifikasi selektif dari suatu wilayah tertentu dari DNA. Ini menggunakan metode PCR menambah banyak, seperti menghasilkan probe hibridisasi Southern hybridization atau utara dan kloning DNA, yang memerlukan sejumlah besar DNA, yang mewakili wilayah DNA spesifik. PCR pasokan teknik ini dengan jumlah yang tinggi DNA murni, memungkinkan analisis sampel DNA bahkan dari jumlah yang sangat kecil dari bahan awal. [Kutipan diperlukan]
Aplikasi lain dari PCR termasuk sekuensing DNA untuk menentukan diketahui PCR-diperkuat urutan di mana salah satu primer amplifikasi dapat digunakan dalam sekuensing Sanger, isolasi dari urutan DNA untuk mempercepat teknologi DNA rekombinan yang melibatkan penyisipan DNA ke dalam urutan plasmid ataubahan genetik organisme lain. Koloni bakteri (E. coli) dapat cepat disaring oleh PCR untuk konstruksi vektor DNA yang benar PCR juga dapat digunakan untuk sidik jari genetik;. Teknik forensik digunakan untuk mengidentifikasi seseorang atau organisme dengan membandingkan DNA melalui berbagai eksperimen PCR berbasis metode [kutipan diperlukan].
Metode 'sidik jari' beberapa PCR memiliki kekuatan diskriminatif yang tinggi dan dapat digunakan untuk mengidentifikasi hubungan genetik antara individu, seperti orang tua-anak atau antara saudara kandung, dan digunakan dalam pengujian paternitas (Gambar 4). Teknik ini juga dapat digunakan untuk menentukan hubungan evolusioner antara organisme [kutipan diperlukan].
Gambar 4: Elektroforesis dari PCR diamplifikasi fragmen DNA. (1) Bapa. (2) Anak.(3) Ibu. Anak telah mewarisi beberapa, tapi tidak semua sidik jari dari setiap orang tua, memberikan sidik jari, baru yang unik.
Amplifikasi dan kuantifikasi DNA
Karena PCR menguatkan daerah DNA yang target, PCR dapat digunakan untuk menganalisa jumlah yang sangat kecil sampel. Hal ini sering penting untuk analisis forensik, ketika hanya sejumlah jejak DNA tersedia sebagai bukti. PCR juga dapat digunakan dalam analisis DNA kuno yang puluhan ribu tahun. Ini berbasis teknik PCR telah berhasil digunakan pada hewan, seperti empat puluh ribu tahun raksasa, dan juga pada DNA manusia, dalam aplikasi mulai dari analisis mumi Mesir untuk identifikasi dari Tsar Rusia.
Metode PCR kuantitatif memungkinkan estimasi dari jumlah urutan yang diberikan hadir dalam teknik sampel-sering diterapkan pada kuantitatif menentukan tingkat ekspresi gen. Real-time PCR adalah alat yang didirikan untuk kuantifikasi DNA yang mengukur akumulasi produk DNA setelah setiap putaran amplifikasi PCR.
Lihat juga Penggunaan DNA dalam forensik entomologi
PCR dalam diagnosis penyakit
PCR memungkinkan diagnosis dini penyakit ganas seperti leukemia dan limfoma, yang saat ini tertinggi yang dikembangkan dalam penelitian kanker dan sudah digunakan secara rutin. (Lihat studi yang dikutip dalam EUTOS Untuk artikel studi CML di http://www.eutos.org/content/molecular_monitoring/information/pcr_testing/, terutama catatan 10-13.) PCR dapat dilakukan langsung pada sampel DNA genom untuk mendeteksi translokasi-spesifik sel-sel ganas pada sensitivitas yang setidaknya 10.000 kali lipat lebih tinggi daripada metode lain [rujukan?].
PCR juga memungkinkan identifikasi mikroorganisme non-cultivatable atau lambat tumbuh seperti mikobakteri, bakteri anaerob, atau virus dari tes kultur jaringan dan model hewan. Dasar untuk aplikasi PCR diagnostik dalam mikrobiologi adalah deteksi agen infeksi dan diskriminasi non-patogen dari strain patogen berdasarkan gen-gen tertentu.
DNA virus juga dapat dideteksi dengan PCR. Primer yang digunakan harus spesifik ke urutan ditargetkan dalam DNA virus, dan PCR dapat digunakan untuk analisis diagnostik atau DNA sekuensing dari genom virus. Sensitivitas tinggi PCR memungkinkan pendeteksian virus segera setelah infeksi dan bahkan sebelum timbulnya penyakit. Deteksi dini tersebut dapat memberikan dokter memimpin signifikan dalam pengobatan. Jumlah virus ("viral load") pada pasien juga dapat diukur dengan PCR DNA berbasis teknik kuantisasi (lihat di bawah).
Variasi pada teknik PCR dasar
Artikel utama: Varian PCR
Alel spesifik PCR: teknik diagnostik atau kloning berdasarkan polimorfisme nukleotida tunggal (SNP) (tunggal-basis perbedaan dalam DNA). Hal ini membutuhkan pengetahuan sebelumnya dari urutan DNA, termasuk perbedaan antara alel, dan menggunakan primer yang 3 'berakhir mencakup SNP. Amplifikasi PCR dalam kondisi ketat jauh kurang efisien dalam adanya ketidaksesuaian antara template dan primer, amplifikasi begitu sukses dengan kehadiran SNP primer spesifik sinyal dari SNP tertentu dalam urutan Lihat SNP genotyping untuk informasi lebih lanjut..
PCR atau Polymerase Majelis Majelis Bersepeda (PCA): sintesis buatan dari sekuens DNA yang panjang dengan melakukan PCR pada kolam oligonukleotida panjang dengan segmen yang tumpang tindih pendek. Oligonukleotida bergantian antara akal dan arah antisense, dan segmen yang tumpang tindih menentukan urutan fragmen PCR, sehingga selektif memproduksi produk DNA akhir panjang.
Asimetris PCR: preferentially menguatkan satu untai DNA dalam template DNA beruntai ganda. Hal ini digunakan dalam sequencing dan hibridisasi menyelidik di mana amplifikasi hanya satu dari dua untai komplementer diperlukan. PCR dilakukan seperti biasa, tapi dengan kelebihan besar dari primer untuk untai ditargetkan untuk amplifikasi. Karena amplifikasi (aritmatika) yang lambat kemudian dalam reaksi setelah membatasi primer telah digunakan sampai, siklus ekstra PCR dibutuhkan Sebuah modifikasi baru pada proses ini, yang dikenal sebagai Linear-Setelah-The-Eksponensial-PCR. ( TERLAMBAT-PCR), menggunakan primer membatasi dengan suhu leleh yang lebih tinggi (Tm) dari primer kelebihan untuk mempertahankan efisiensi reaksi sebagai konsentrasi primer membatasi menurun pertengahan reaksi.
Helikase tergantung amplifikasi: mirip dengan PCR tradisional, tetapi menggunakan suhu konstan daripada bersepeda melalui denaturasi dan anil / siklus ekstensi. DNA helikase, enzim yang unwinds DNA, digunakan di tempat denaturasi termal.
Hot mulai PCR: suatu teknik yang mengurangi non-spesifik amplifikasi selama set up awal tahapan PCR. Ini dapat dilakukan secara manual dengan memanaskan komponen reaksi suhu denaturasi (misalnya, 95 ° C) sebelum menambahkan polimerase . Sistem enzim khusus telah dikembangkan yang menghambat aktivitas polimerase pada suhu ambien, baik oleh pengikatan suatu antibodi atau oleh kehadiran inhibitor yang terikat kovalen yang terdisosiasi setelah langkah aktivasi suhu-tinggi. Hot-start/cold-finish PCR dicapai dengan polimerase hibrida baru yang sudah tidak aktif pada suhu ambien dan langsung diaktifkan pada suhu perpanjangan.
Intersequence khusus PCR (ISSR):. Metode PCR untuk DNA fingerprinting yang menguatkan wilayah antara mengulangi urutan sederhana untuk menghasilkan sidik jari unik dari panjang fragmen diamplifikasi
Invers PCR: umumnya digunakan untuk mengidentifikasi urutan genom mengapit sekitar sisipan. Ini melibatkan serangkaian pencernaan DNA dan ligasi diri, sehingga urutan dikenal di kedua ujung dari urutan yang tidak diketahui.
Ligasi-dimediasi PCR: menggunakan linker DNA kecil diikat dengan DNA kepentingan dan beberapa primer anil ke linker DNA, telah digunakan untuk sekuensing DNA, berjalan genom, dan footprinting DNA .
Metilasi khusus PCR (MSP): dikembangkan oleh Stephen Baylin dan Jim Herman di Johns Hopkins School of Medicine, dan digunakan untuk mendeteksi metilasi pulau CpG dalam DNA genomik. DNA pertama kali diobati dengan natrium bisulfit, yang mengubah basis unmethylated sitosin ke urasil, yang diakui oleh PCR primer sebagai timin. Dua PCR kemudian dilakukan pada DNA dimodifikasi, menggunakan primer set identik kecuali pada setiap pulau CpG dalam urutan primer. Pada titik-titik, satu set primer DNA dengan sitosin mengakui untuk memperkuat DNA alkohol, dan satu set mengakui DNA dengan urasil atau timin untuk memperkuat DNA unmethylated. MSP qPCR menggunakan juga dapat dilakukan untuk mendapatkan kuantitatif daripada informasi kualitatif tentang metilasi.
Miniprimer PCR: menggunakan polimerase termostabil (S-TBR) yang dapat diperluas dari primer pendek ("smalligos") sesingkat 9 atau 10 nukleotida. Metode ini memungkinkan PCR menargetkan untuk wilayah primer lebih kecil mengikat, dan digunakan untuk memperkuat urutan DNA dilestarikan, seperti gen 16S rRNA (atau 18S eukariotik) .
Multiplex Ligasi-tergantung Probe Amplifikasi (MLPA): memungkinkan beberapa sasaran harus diperkuat dengan hanya sepasang primer tunggal, sehingga menghindari keterbatasan resolusi dari multipleks PCR (lihat di bawah).
Multiplex-PCR: terdiri dari beberapa set primer dalam campuran PCR tunggal untuk menghasilkan amplikon dari berbagai ukuran yang spesifik untuk sekuens DNA yang berbeda. Dengan penargetan gen sekaligus, informasi tambahan dapat diperoleh dari satu tes yang dijalankan yang tidak akan membutuhkan beberapa kali reagen dan lebih banyak waktu untuk melakukan. Temperatur anil untuk masing-masing set primer harus dioptimalkan untuk bekerja dengan benar dalam reaksi tunggal, dan ukuran amplikon. Artinya, basis panjang pasangan mereka harus cukup berbeda untuk membentuk band yang berbeda ketika divisualisasikan dengan elektroforesis gel.
PCR nested: meningkatkan spesifisitas amplifikasi DNA, dengan mengurangi latar belakang karena non-spesifik amplifikasi DNA. Dua set primer yang digunakan dalam dua PCR berturut-turut. Dalam reaksi pertama, sepasang primer yang digunakan untuk menghasilkan produk DNA, yang selain sasaran yang dituju, masih dapat terdiri dari non-spesifik fragmen DNA diamplifikasi. Produk (s) yang kemudian digunakan dalam PCR kedua dengan satu set primer yang mengikat situs yang sepenuhnya atau sebagian berbeda dari dan terletak 3 'dari tiap primer yang digunakan dalam reaksi pertama. PCR nested sering lebih berhasil dalam memperkuat fragmen DNA spesifik panjang daripada PCR konvensional, tetapi membutuhkan pengetahuan lebih rinci tentang urutan target.
Tumpang tindih-ekstensi PCR atau Penyambungan dengan ekstensi tumpang tindih (BUMN): teknik rekayasa genetika yang digunakan untuk sambatan bersama-sama fragmen DNA dua atau lebih yang mengandung urutan komplementer. Hal ini digunakan untuk bergabung potongan DNA yang mengandung gen, urutan peraturan, atau mutasi, teknik ini memungkinkan penciptaan konstruksi DNA spesifik dan panjang.
PCR kuantitatif (Q-PCR): digunakan untuk mengukur kuantitas produk PCR (umumnya secara real-time). Ini kuantitatif mengukur jumlah awal DNA, cDNA, atau RNA. Q-PCR umumnya digunakan untuk menentukan apakah urutan DNA hadir dalam sampel dan jumlah salinan dalam sampel. Kuantitatif real-time PCR memiliki tingkat yang sangat presisi yang tinggi. QRT-PCR (atau QF-PCR) metode menggunakan pewarna fluorescent, seperti Sybr Hijau, EvaGreen atau probe DNA yang mengandung fluorophore, seperti TaqMan, untuk mengukur jumlah produk diperkuat secara real time. Hal ini juga kadang-kadang disingkat RT-PCR (Real Time PCR) atau RQ-PCR. QRT-PCR atau RTQ-PCR kontraksi lebih tepat, karena RT-PCR umumnya mengacu pada transkripsi balik PCR (lihat di bawah), sering digunakan dalam hubungannya dengan Q-PCR.
Transkripsi sebaliknya PCR (RT-PCR): untuk memperkuat DNA dari RNA. Reverse reverse transcriptase mentranskripsi RNA menjadi cDNA, yang kemudian diperkuat dengan PCR. RT-PCR secara luas digunakan dalam profil ekspresi, untuk menentukan ekspresi gen atau untuk mengidentifikasi urutan dari transkrip RNA, termasuk start transkripsi dan situs terminasi. Jika urutan DNA genomik gen diketahui, RT-PCR dapat digunakan untuk memetakan lokasi ekson dan intron dalam gen. Ujung 5 'dari gen (sesuai dengan situs awal transkripsi) biasanya diidentifikasi oleh RACE-PCR (Amplifikasi cDNA Berakhir Cepat).
Fase padat PCR: mencakup beberapa arti, termasuk Amplifikasi Polony (di mana koloni PCR diturunkan dalam matriks gel, misalnya), Jembatan PCR (primer yang kovalen terkait dengan permukaan padat-dukungan), Fase Padat PCR konvensional (di mana PCR asimetris diterapkan di hadapan primer bantalan dukungan solid dengan urutan pencocokan salah satu primer berair) dan Fase Padat Peningkatan PCR (di mana Fase Padat PCR konvensional dapat ditingkatkan dengan menggunakan Tm tinggi dan bersarang primer dukungan yang solid dengan aplikasi opsional dari 'langkah' termal untuk mendukung priming dukungan yang solid).
Termal interlaced PCR asimetris (TAIL-PCR): untuk isolasi dari urutan diketahui mengapit urutan yang dikenal. Dalam urutan yang dikenal, TAIL-PCR menggunakan sepasang bersarang primer dengan berbeda suhu anil; primer merosot digunakan untuk memperkuat ke arah lain dari urutan yang tidak diketahui .
Touchdown PCR (PCR Langkah-down): sebuah varian dari PCR yang bertujuan untuk mengurangi latar belakang spesifik dengan secara bertahap menurunkan suhu annealing PCR bersepeda sebagai berlangsung. Suhu anil pada siklus awal biasanya beberapa derajat (3-5 ° C) di atas Tm dari primer yang digunakan, sedangkan pada siklus selanjutnya, itu adalah beberapa derajat (3-5 ° C) di bawah primer Tm. Suhu yang lebih tinggi memberikan spesifisitas yang lebih besar untuk mengikat primer, dan suhu yang lebih rendah memungkinkan amplifikasi lebih efisien dari produk tertentu yang terbentuk selama siklus awal .
PAN-AC: menggunakan kondisi isotermal untuk amplifikasi, dan dapat digunakan dalam sel hidup .
Berjalan Cepat Universal: untuk berjalan genom dan sidik jari genetik menggunakan lebih spesifik 'dua sisi' PCR dari konvensional 'satu sisi' pendekatan (hanya menggunakan satu gen spesifik primer dan satu primer umum - yang dapat menyebabkan artefactual 'kebisingan') berdasarkan mekanisme yang melibatkan pembentukan struktur tali penjerat ternak. Derivatif streamline UFW adalah Lane RAGE (menjerat tergantung PCR nested untuk amplifikasi cepat berakhir DNA genom), 5'RACE Lane dan 3'RACE Lane .
Sejarah
Artikel utama: Sejarah reaksi berantai polimerase
Sebuah kertas 1971 di Journal of Molecular Biology oleh Kleppe dan rekan kerja pertama kali menggambarkan sebuah metode menggunakan assay enzimatik untuk mereplikasi DNA pendek template dengan primer secara in vitro Namun., Ini manifestasi awal dari prinsip PCR dasar tidak menerima banyak perhatian, dan penemuan reaksi berantai polimerase pada tahun 1983 umumnya Kary Mullis dikreditkan ke.
Ketika Mullis mengembangkan PCR pada tahun 1983, dia bekerja di Emeryville, California untuk Cetus Corporation, salah satu perusahaan bioteknologi pertama.Di sana, dia bertanggung jawab untuk sintesis DNA rantai pendek. Mullis telah menulis bahwa ia dikandung PCR sambil meluncur di sepanjang Pacific Coast Highway satu malam di dalam mobil . Dia sedang bermain dalam pikirannya dengan cara baru menganalisis perubahan (mutasi) dalam DNA ketika ia menyadari bahwa ia bukan diciptakan metode memperkuat setiap daerah DNA melalui siklus berulang duplikasi didorong oleh DNA polimerase. Dalam Scientific American, Mullis prosedur diringkas: "Dimulai dengan satu molekul DNA bahan genetik, PCR dapat menghasilkan 100 miliar molekul serupa di sore reaksi ini mudah untuk melaksanakan ini membutuhkan tidak lebih dari sebuah tabung uji,..reagen sederhana, dan sumber panas. " Dia dianugerahi Penghargaan Nobel dalam Kimia pada tahun 1993 untuk penemuan, tujuh tahun setelah ia dan rekan-rekannya di Cetus pertama kali proposal untuk berlatih. Namun, beberapa kontroversi tetap tentang kontribusi intelektual dan praktis dari ilmuwan lain untuk bekerja Mullis ', dan apakah ia telah penemu tunggal prinsip PCR (lihat di bawah).
Pada inti dari metode PCR adalah penggunaan DNA polimerase yang cocok mampu menahan suhu tinggi> 90 ° C (194 ° F) diperlukan untuk pemisahan dari dua untai DNA dalam heliks ganda DNA setelah setiap siklus replikasi. DNA polimerase awalnya digunakan dalam percobaan in vitro presaging PCR tidak mampu menahan suhu tinggi ini Jadi prosedur awal untuk replikasi DNA sangat memakan waktu dan tidak efisien, dan jumlah besar diperlukan DNA polimerase dan penanganan kontinyu sepanjang proses..
Penemuan pada tahun 1976 polimerase Taq - polimerase DNA dimurnikan dari bakteri termofilik, aquaticus Thermus, yang secara alami hidup di panas (50 sampai 80 ° C (122-176 ° F)) lingkungan seperti sumber air panas - yang beraspal jalan bagi perbaikan dramatis dari metode PCR. DNA polimerase terisolasi dari T. aquaticus stabil pada suhu tinggi tetap aktif bahkan setelah denaturasi DNA, sehingga menghindarkan kebutuhan untuk menambahkan polimerase DNA baru setelah setiap siklus. Hal ini memungkinkan sebuah thermocycler otomatis berbasis proses amplifikasi DNA .
Paten perang
Teknik PCR Kary Mullis dipatenkan oleh dan ditugaskan untuk Cetus Corporation, di mana Mullis bekerja ketika ia menemukan teknik ini pada tahun 1983. Taq polimerase enzim ini juga diliput oleh paten. Ada beberapa profil tinggi tuntutan hukum yang berhubungan dengan teknik, termasuk gugatan tidak berhasil dibawa oleh DuPont. Perusahaan farmasi Hoffmann-La Roche membeli hak atas paten pada tahun 1992 dan saat ini memegang mereka yang masih dilindungi.
Sebuah pertempuran paten terkait selama enzim polimerase Taq masih berlangsung di beberapa yurisdiksi di seluruh dunia antara Roche dan Promega.Argumen-argumen hukum yang melampaui kehidupan PCR asli dan paten polimerase Taq, yang berakhir pada tanggal 28 Maret 2005.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar